PCR, yaiku reaksi berantai polimerase, sing nuduhake tambahan dNTP, Mg2+, faktor elongasi lan faktor peningkatan amplifikasi menyang sistem ing sangisore katalisis DNA polimerase, nggunakake DNA induk minangka cithakan lan primer spesifik minangka titik wiwitan extension , Liwat langkah-langkah denaturasi, annealing, extension, lan liya-liyane, proses in vitro replikasi DNA untai putri sing komplementer menyang DNA cithakan untaian induk bisa kanthi cepet lan khusus nggedhekake DNA target ing vitro.
1. Hot Mulai PCR
Wektu wiwitan amplifikasi ing PCR konvensional ora nglebokake mesin PCR menyang mesin PCR, banjur program kasebut wiwit nggedhekake.Nalika konfigurasi sistem rampung, amplifikasi diwiwiti, sing bisa nyebabake amplifikasi non-spesifik, lan PCR wiwitan panas bisa ngatasi masalah iki.
Apa PCR wiwitan panas?Sawise sistem reaksi disiapake, pengubah enzim dibebasake ing suhu dhuwur (biasane luwih dhuwur tinimbang 90 ° C) nalika tahap pemanasan awal reaksi utawa tahap "mumula panas", supaya polimerase DNA diaktifake.Wektu aktivasi lan suhu sing tepat gumantung marang sifat polimerase DNA lan modifier wiwitan panas.Cara iki utamane nggunakake modifier kayata antibodi, ligan afinitas, utawa modifier kimia kanggo nyegah aktivitas polimerase DNA.Wiwit aktivitas polimerase DNA dicegah ing suhu kamar, teknologi wiwitan panas nyedhiyakake penak banget kanggo nyiapake macem-macem sistem reaksi PCR ing suhu kamar tanpa ngorbanake kekhususan reaksi PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) minangka teknik eksperimen kanggo transkripsi mbalikke saka mRNA menyang cDNA lan digunakake minangka cithakan kanggo amplifikasi.Prosedur eksperimen yaiku ngekstrak total RNA ing jaringan utawa sel dhisik, nggunakake Oligo (dT) minangka primer, nggunakake reverse transcriptase kanggo sintesis cDNA, banjur nggunakake cDNA minangka cithakan kanggo amplifikasi PCR kanggo entuk gen target utawa ndeteksi ekspresi gen.
3. PCR kuantitatif neon
PCR kuantitatif neon (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) nuduhake cara nambahake kelompok neon menyang sistem reaksi PCR, nggunakake akumulasi sinyal neon kanggo ngawasi kabeh proses PCR ing wektu nyata, lan pungkasane nggunakake kurva standar kanggo nganalisis cithakan kanthi kuantitatif.Cara qPCR sing umum digunakake kalebu SYBR Green I lan TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR nuduhake panggunaan rong set primer PCR kanggo rong putaran amplifikasi PCR, lan produk amplifikasi babak kapindho yaiku fragmen gen target.
Yen ora cocog saka pasangan primer pisanan (primer njaba) nyebabake prodhuk non-spesifik digedhekake, kemungkinan wilayah non-spesifik sing padha diakoni dening pasangan primer kapindho lan terus nggedhekake cilik banget, saengga amplifikasi dening pasangan primer kapindho, spesifisitas PCR wis ditingkatake.Siji kauntungan saka nindakake rong babak PCR yaiku mbantu nggedhekake produk sing cukup saka DNA wiwitan sing winates.
5. PCR tutul
Touchdown PCR minangka cara kanggo nambah kekhususan reaksi PCR kanthi nyetel paramèter siklus PCR.
Ing PCR touchdown, suhu anil kanggo sawetara siklus pisanan disetel sawetara derajat ing ndhuwur suhu anil maksimum (Tm) saka primer.Suhu annealing sing luwih dhuwur bisa nyuda amplifikasi non-spesifik kanthi efektif, nanging ing wektu sing padha, suhu annealing sing luwih dhuwur bakal nambah pemisahan primer lan urutan target, sing nyebabake nyuda ngasilake PCR.Mulane, ing sawetara siklus pisanan, suhu anil biasane disetel kanggo ngurangi 1 ° C saben siklus kanggo nambah isi gen target ing sistem.Nalika suhu annealing diturunake menyang suhu paling luweh, suhu annealing tetep kanggo siklus sing isih ana.
6. PCR langsung
PCR langsung nuduhake amplifikasi DNA target langsung saka sampel tanpa perlu isolasi lan pemurnian asam nukleat.
Ana rong jinis PCR langsung:
cara langsung: njupuk jumlah cilik saka sampel lan nambah langsung menyang PCR Master Mix kanggo identifikasi PCR;
cara cracking: sawise sampling sampel, nambah menyang lysate ing, lyse kanggo release génom, njupuk jumlah cilik saka lysed supernatant lan ditambahake menyang PCR Master Mix, nindakake identifikasi PCR.Pendekatan iki nyederhanakake alur kerja eksperimen, nyuda wektu langsung, lan ngindhari mundhut DNA sajrone langkah pemurnian.
7. PCR BUMN
Penyambungan gen kanthi overlap extension PCR (SOE PCR) nggunakake primer kanthi ujung pelengkap kanggo nggawe produk PCR mbentuk rantai tumpang tindih, saéngga ing reaksi amplifikasi sabanjure, liwat ekstensi rantai tumpang tindih, macem-macem sumber teknik A sing fragmen amplifikasi tumpang tindih. lan disambungake bebarengan.Teknologi iki saiki duwe rong arah aplikasi utama: konstruksi gen fusi;mutasi gen site-directed.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) nggunakake primer komplementer mbalikke kanggo nggedhekake fragmen DNA liyane saka rong primer, lan nggedhekake urutan sing ora dingerteni ing loro-lorone fragmen DNA sing dikenal.
IPCR wiwitane dirancang kanggo nemtokake urutan wilayah sing ora dingerteni, lan biasane digunakake kanggo nyinaoni urutan promotor gen;penyusunan ulang kromosom onkogenik, kayata fusi gen, translokasi lan transposisi;lan integrasi gen virus, uga umum digunakake saiki Kanggo mutagenesis sing diarahake situs, nyalin plasmid kanthi mutasi sing dikarepake.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) minangka teknik kanggo kuantifikasi absolut molekul asam nukleat.
Saiki ana telung cara kanggo ngitung molekul asam nukleat.Photometry adhedhasar absorbansi molekul asam nukleat;PCR kuantitatif fluoresensi nyata-wektu (Real Time PCR) adhedhasar nilai Ct, lan nilai Ct nuduhake nomer siklus sing cocog karo nilai fluoresensi sing bisa dideteksi;PCR digital minangka teknologi Kuantitatif paling anyar adhedhasar metode PCR molekul siji kanggo ngitung kuantifikasi asam nukleat minangka cara kuantitatif absolut.
Wektu kirim: Jun-13-2023